Kompletní popis metody polymerázové řetězové reakce

Polymerázová řetězová reakce (PCR) je vytvoření více kopií krátké části lidské DNA. Malé množství fyziologického materiálu je nezbytné pro výzkum a získání výsledků: sputum, krev, plodová voda, sliny, moč, atd.

Co je to polymerázová řetězová reakce?

Metoda PCR byla vyvinuta americkým vědcem Melisonem, který v roce 1998 obdržel Nobelovu cenu za jeho vývoj. Aktivně používané:

• s včasnou diagnózou infekcí, onkologickými patologiemi;
• při forenzním vyšetření pro studium extrémně malého množství DNA;
• ve veterinární medicíně, biologii, molekulární genetice;
• pro osobní identifikaci DNA;
• potvrdit otcovství;
• v ekologii, například při sledování a kvalitě produktu v antropologii.

Kdo je předepsán PCR?

Polymerázová řetězová reakce v diagnostice infekčních patologií je jednou z nejspolehlivějších metod, která poskytuje nejpřesnější a nejspolehlivější analýzu. Například spolehlivost analýzy chlamydií se blíží 100%. Nejčastěji je toto diagnostické opatření předepsáno pacientům, kteří mají během testu potíže s identifikací určitého patogenu.

PCR laboratorní testy používají:

1. Hledání patogenních organismů, které způsobují infekci močového a genitálního traktu, je obtížné identifikovat při aplikaci plodin nebo metody imunologie.
2. Pro re-analýzu HIV v počáteční fázi s pozitivním, ale sporným výsledkem počáteční analýzy, například u novorozenců z infikovaných rodičů.
3. Stanovení onkologické patologie v raném stádiu a individuální korekce léčebného režimu u pacientů.
4. Pro včasnou detekci a potenciální léčbu dědičných patologií. Mnozí budoucí rodiče zkoušejí, zda jsou nositeli genetických onemocnění. U dětí tato metoda určuje pravděpodobnost expozice nemocí, které jsou dědičné.

Tato technika se také používá:

• pro detekci patologie plodu v časném těhotenství;
• u pacientů před chirurgickým zákrokem k transplantaci orgánů - nutné ke stanovení kompatibility tkání
• detekovat nebezpečné patogeny v krvi dárce;
• u novorozenců odhalit skryté infekce;
• vyhodnotit výsledky antivirové nebo antimikrobiální léčby.

Proč projít tímto postupem?

Vzhledem k tomu, že PCR je považována za vysoce účinnou diagnostickou metodu, která dává téměř 100% výsledků, používá se tento postup:

1. Potvrzení nebo vyloučení diagnózy.
2. Pro rychlé zhodnocení účinnosti léčby.
3. V mnoha případech je tato metoda považována za jediný možný způsob detekce vyvíjející se patologie, pokud se ukázalo, že jiné bakteriologické, virologické techniky jsou k ničemu.
4. Viry využívající PCR postup jsou detekovány bezprostředně po infekci a před nástupem hlavních symptomů.
5. Včasná detekce mikroorganismů umožní rychlé ošetření.

PCR analýza vám navíc umožní rychle detekovat malý počet mikroorganismů v živých nebo mrtvých vzorcích. Tato technika se proto používá pro vyhledávání specifického patogenního organismu, například bacil tuberkul.

Dále se používá PCR analýza:

• stanovení citlivosti DNA na specifické typy antibiotik, které umožní co nejrychleji zahájit léčbu;
• kontrolovat šíření epidemií;
• identifikovat a sledovat nové typy mikrobů, patogenů.

Hlavní typy PCR

Standardní metoda

PCR analýza se provádí na základě vícenásobného zdvojení specifického DNA fragmentu a RNA pomocí primerových enzymů. Díky tomu obdrží badatel potřebné množství materiálu.

PCR v reálném čase

V tomto typu výzkumu je proces identifikace daného fragmentu zahájen po průchodu každým cyklem. Tento typ výzkumu umožňuje získat informace o počtu virů a mikroorganismů v těle, tj. Provést kvantitativní analýzu.

Reverzní transkripční režim z PCR

Tato analýza se používá pro vyhledávání jednovláknové RNA pro další detekci virů, jejichž genetická báze se nazývá RNA. Je to například virus hepatitidy C, imunodeficience a tak dále. Při provádění této studie se používá speciální enzym, díky kterému se vytváří jednovláknová DNA. Systém pak obnoví druhý řetězec DNA a provede tradiční postup.

Indikace pro

PCR postup se používá na klinikách infekčních onemocnění, porodnictví, urologie, gynekologie a nefrologie, pediatrie a podobně. Nejběžnější indikace pro analýzu přiřazení jsou následující:

• stanovit riziko vzniku genetických abnormalit u dítěte v přítomnosti dědičných patologií;
• diagnostikovat oba rodiče při plánování těhotenství nebo v době, kdy je matka v těžkém stavu při přepravě dítěte;
• s obtížemi v koncepci identifikovat příčiny neplodnosti;
• v případě podezření na sexuální infekce v akutním stadiu nebo při riziku přechodu do chronického stadia;
• odhalit příčiny zánětlivých procesů neznámého původu;
• s nechráněným náhodným sexem;
• stanovení citlivosti patogenního mikroorganismu na specifické léčivo;
• podezření na latentní infekci k detekci patogenů bez zjevných symptomů;
• potvrdit uzdravení z nemoci, tj. retrospektivní diagnózu.

Také PCR se používá, když je nezbytné přesně identifikovat takové patogeny, jako jsou viry hepatitidy, lidská imunodeficience, cytomegalovirus, virus herpes simplex, virus zarděnky, virus papilloma.

Tato metoda se používá k určení infekcí: infekční mononukleóza, encefalitida přenášená klíšťaty, kandidóza, která je způsobena houbami Candida, infekcemi genitálií a tuberkulózou.

Pokud jsou kontraindikace a bezpečná metoda?

Vzhledem k tomu, že se tento postup provádí bez jakéhokoliv dopadu na tělo a je používán pouze biologický materiál, který je určen pro výzkum, neexistují žádné kontraindikace kvůli absenci potenciálního nebezpečí pro tělo. Například odběr vzorku biomateriálu z děložního čípku děložního se po kolposkopii neprovádí. Dodací nátěr, stěrky jsou povoleny pouze 4-7 dnů po ukončení menstruace a úplném ukončení výtoku.

Charakteristiky přípravy postupu

Jako vzorek pro PCR analýzu, ve které je detekována DNA cizího patogenu, se použije buď biologická tekutina nebo tkáň. Příjem testované látky probíhá ve formě odběru krve ze žíly, škrábání z nosní dutiny, hrtanu, děložního hrdla, močové trubice. Před diagnostickým postupem musí lékař pacientovi vysvětlit, jaký materiál bude odebrán:

• při analýze herpetických infekcí, mononukleóza provede analýzu moči, stejně jako stěr z hltanu;
• při testování na hepatitidu nebo toxoplazmózu se odebírá krev ze žíly;
• za účelem diagnostiky různých typů poškození CNS je odebrána mozkomíšní tekutina;
• v pulmonologii jsou vzorky pro analýzu PCR pleurální tekutinou a sputem;
• provádí-li studii intrauterinních infekcí během těhotenství, pro analýzu se používají placentární buňky.

Spolehlivost a přesnost výsledku závisí na sterilitě a podmínkách odebrání biomateriálu. Vzhledem k tomu, že studie PCR jsou vysoce citlivé, může jakákoli kontaminace přijaté látky narušit výsledky. Kompetentní příprava na dodávku biomateriálu nepředstavuje pro pacienta žádné obtíže.

Existuje však několik doporučení:

• při analýze pohlavně přenosných infekcí je nutné vyloučit intimní kontakty tři dny před dodáním materiálu;
• 72 hodin by mělo zastavit užívání jakýchkoli vaginálních přípravků;
• od večera předešlého dne nelze provádět žádnou hygienu studovaných oblastí
• 3-4 hodiny před odebráním vzorku z močové trubice by mělo být vyloučeno močení;
• měsíc před provedením testů musíte přestat užívat antibiotika;
• krev se podává ráno nalačno před jídlem a pitím;
• Ranní moč je po odchodu na záchod shromážděn ve sterilní nádobě.

Jak je PCR?

Při provádění výzkumu ve speciálním reaktoru se opakuje určitý cyklus:

1. První krok. Denaturace. Sliny, krev, gynekologické vzorky a další látky se umístí do aplikátoru, kde se materiál zahřeje a DNA se rozdělí na dva řetězce.
2. Druhý krok. Mírné ochlazení odebrané látky, přidáním k němu speciální komponenty, které rozpoznávají nezbytné části molekuly DTC a váží se na ni.
3. 3 krok. Prodloužení Během procesu je fragment DTC patogenního organismu dokončen, je vytvořena jeho kopie. Tento cyklus se opakuje, což zdvojnásobuje kopii specifického fragmentu DNA.

Za pár hodin se vytvoří mnoho kopií tohoto fragmentu, odhalí se jejich přítomnost ve vzorcích. Následně jsou výsledky porovnány s databázemi různých typů patogenů. To vám umožní určit typ infekce.

Vlastnosti dekódovací analýzy?

Konečný výsledek studie bude pacientovi podán několik dní po biologické analýze.

Kvalitativní analýza

Negativní výsledek v tomto případě znamená, že v tekutině, která byla podána k testování, nebyla detekována žádná infekční látka. Pozitivní výsledek ukazuje detekci patogenních virů nebo bakterií v biologickém vzorku. Pokud byl výsledek pozitivní, ale zároveň osoba nemá žádné známky aktivace infekce, tento stav těla se nazývá asymptomatický zdravý nosič.

Nejčastěji je to pozorováno při užívání biomateriálu ve virových patologiích. V tomto případě není léčba nutná, vyžaduje však neustálý lékařský dohled. Jelikož za takových podmínek existuje pravděpodobnost:

• šíření viru z nosiče na zdravé lidi;
• aktivace procesu a přechod patologie na chronickou formu.

Kvantitativní analýza

Kvantitativní výsledek stanoví odborník speciálně pro určitý typ infekce. Na základě získaných výsledků je možné posoudit stupeň vývoje, stadium patologie, které umožňuje co nejrychleji předepsat léčbu.